基因芯片诊断技术最新进展及市场应用分析
南方医科大学基因工程研究所（510515） 马文丽
华南基因组研究中心（510000） 郑文岭
【摘要】 基因芯片技术把数以万计的基因片段以显微点阵的方式排列在固体介质表面，实现了基因的快速、高通量、敏感和高效率检测。基因芯片近年发展快速，随着实验室商用基因芯片产品的出现，DNA芯片技术研究的应用得到快速推广，已在多个领域取得进展。基因芯片可针对多靶点，对单个基因组进行检测，因而可作为高分辨的疾病基因诊断技术；全基因组基因芯片则可检测全基因组和功能基因组的状态，可进行健康监控、健康管理并可对疾病进行预测。基因芯片发展的主要限速环节有：基因芯片制作成本较高、操作过程较繁琐和对大规模数据挖掘新技术的需求。一旦这些限速环节得到克服，基因芯片诊断产品将应用于巨大的健康管理市场。
【关键词】 基因芯片；诊断技术；健康管理
DNA Chip Advancements and Applications
MA1 Wen Li, ZHENG2 Wen Ling.1.South Medical University 510515,China；2．South Genomics Research Center 510000,China
【Abstract】 By incorporating thousands of gene fragments into DNA microarray, DNA chip technology could detection gene alterations in greater speed, throughput, sensitivity and efficiency. The DNA chip (or microarray ) technology has been advanced quickly over the recent years, enabling expanded applications in many research areas with great achievements. DNA microarray could locate multiple targets in a single genome, thus increasing the definition of the gene diagnosis. The whole genome DNA chips could be used in global screening of the genome as well as gene expression profile, which will enable not only diagnosis, but also surveillance and prediction of the diseases. Currently, there are still several major speed limiting factors precluding DNA microarray into further medical applications, namely the high cost of the manufacture, the complex of the probe labeling procedures as well as the requirements of more sophisticated microarray data analysis tools. It has been expected that the DNA microarray could be greatly extended into the vast market of biomedical applications, as soon as those speed-limiting obstacles overcome.
【Key words】
DNA microarray；diagnostics；health management
基因芯片技术是近年来兴起的生物高新技术，把数以万计的基因片段以显微点阵的方式排列在固体介质表面，可以实现基因检测的快速、高通量、敏感和高效率检测，将可能为临床疾病诊断和健康监测等领域，带来全新的技术并开拓广阔的市场。
一．基因芯片技术的产生与发展背景：
基因芯片技术的研制开发起始于上世纪九十年代初，美国国家自然科学基金首先资助了两个DNA芯片的制作方案。其一是斯坦福大学的P. Brown实验室提出的点阵打印式基因芯片，将DNA通过合成的方式首先合成出来，然后制成点样液并显微点印在平方厘米的固体介质表面。第二种方案是美国Affymetrix公司S. Foder的研究小组，其研制原理与计算机芯片的制备过程类似，即采用激光引导的原位光刻技术，使DNA片段的序列被原位合成延伸。两种技术途径各有优缺点，前者可以合成较长的DNA片段再进行点印，但密度不及后者；而第二种方案可以达到每平方厘米数十万个点阵的高密度，但目前DNA序列的长度一般仅在20mer左右。
基因芯片技术近年来发展迅速，最新的研究进展主要体现在基因芯片的应用领域。随着实验室科研用基因芯片产品的出现，DNA芯片的技术研究应用如雨后春笋般地推广，芯片研究方面的应用已普及到生物学几乎所有的方面。近期基因芯片最新的发展包括以下内容：
1、60-70mer Oligo芯片的应用推广：原位点印技术虽然理论上可以采用各种来源的DNA片段作为点阵制作的原料，但研究发现，70mer左右长度的单链DNA片段，可以最优化地反映其所代表的基因；
2、SNP芯片的研制：SNP（Single Nucleotide Polymorphism）即单核苷酸多态性，指基因组中微小的基因序列差异。将大量这种差异序列制作成SNP芯片，理论上认为可反应人体功能和疾病反应性差异,是个体化用药或个体化医疗（personalized medicine）的基因组学基础。目前研究倾向于特殊SNP谱图（pattern）的发现与确认。SNP谱不仅可用于更精确的个体识别，而且可用于个体疾病易感性的检测；
3、mCGH的应用：CGH（comparative genome hybridization）即比较基因组杂交。CGH虽然是一个传统的技术，其与DNA芯片技术结合可形成基因芯片-CGH（microarray CGH or mCGH）技术，由于可高通量地比对基因组的结构和组成，在肿瘤、新药研究、药物敏感性以及新疗法的开拓中已开始发挥着重要的作用；
4、基因表达谱研究：基因表达谱研究（gene expression profile）可以高通量地检测基因表达信息，因而，对功能基因组的研究起到重要作用。基因表达谱的研究虽然已有较大的发展，但由于功能状态下基因表达的动态差异性，因而检测结果需要采用传统的分子生物学技术如Northern印迹或RT-PCR等加以验证，后者是基因表达谱研究的限速过程；
5、数据挖掘：采用生物信息学及系统生物学原理，分析基因芯片应用过程中产生的海量数据，并根据数据的归类，分析基因表达或比较基因组的差异，进而探索上述差异所反映出的生物学功能机制。数据挖掘是基因芯片研究和应用的重要组成部分，目前在软件开发和应用分析等多个方面仍属于起步阶段；
6、疾病诊断用基因芯片：与高通量基因芯片相比较，以特异疾病诊断为目的而制备的小型芯片，可以达到快速、敏感、准确和高通量地诊断和鉴别诊断的目的。小型芯片虽然制备过程相对简化，但由于将应用于疾病的诊断，因而在探针准备、样品标记等多个方面，均需要更加精密的设计。
经过十多年的快速发展，虽然基因芯片产品尚未最后应用于临床基因诊断，但该技术已经日臻成熟，市场化应用的推广过程已经呼之欲出。
二．基因芯片诊断技术市场应用分析：
基因芯片技术在诊断中的应用研究目前仍然方兴未艾。由于基因芯片可以多靶点地对单个基因组进行检测，因而是目前常规的基因诊断所不能比拟的。本文以SARS冠状病毒基因芯片的制备为例，讨论基因芯片在病原体诊断中的设计与研制过程。
2003 年4 月, 与严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)相关的一种新型冠状病毒的基因组全序列被测定, 该病毒基因组全长为29727 bp, 有11 个可读框(图1), 其基因组构成与其他冠状病毒有相似性. 而遗传学分析和序列比对表明, SARS 冠状病毒(SARS- CoV)与其他已知的冠状病毒同源性不高, 表明SARS-CoV 可能为一种非人源性病毒。SARS发病急、传染快， 只有对病人给予早期、快速和准确的诊断和隔离, 才能有效地消除传染源。但采用常规的临床诊断技术，如免疫学方法、RT-PCR，荧光定量PCR 等，虽然也可以诊断SARS冠状病毒的存在，但免疫学方法早期敏感性较低，而PCR技术存在一定程度的假阳性和假阴性。特别是上述方法只能针对SARS冠状病毒较局限的靶抗原或靶基因位点，不易达到对SARS病毒的早期快速敏感和准确的诊断。
图1 针对SARS冠状病毒全长基因组（约30K），可设计多个靶探针检测位点
根据SARS冠状病毒的TOR2 株为参考序列, 通过设计出30条特异的60 mer寡核苷酸（oligo）,制备oligo基因芯片, 如图1所示，可用于SARS-CoV 的的检测。SARS冠状病毒基因组寡核苷酸基因芯片，根据寡核苷酸基因芯片的原理设计, 覆盖SARS冠状病毒基因组, 点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片, 从临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA, 采用Cy3进行标记, 将标记好的样品与芯片杂交, 洗脱, 扫描。杂交结果表明, 来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交, 显示明确的荧光信号（图2）; 阴性和空白对照探针上没有杂交信号, 该结果实现了对SARS冠状病毒感染的早期检测.
图2
SARS冠状病毒检测的诊断用基因芯片（略）
基因芯片诊断的优越性是明显的。诊断用基因芯片技术可以从基因水平确切地发现疾病最早期的分子改变，可为早期预防、诊断和治疗提供新技术。由于多数疾病的发生和发展都是从基因改变开始的，因而，从基因水平发现的改变，为从基因水平对疾病进行早期干预成为可能。
在传染性疾病的早期诊断中，基因诊断具有特殊的意义。对于HIV、HBV、HCV等病毒感染，基因诊断可以发现早期窗口期的病例，从而为血库检验提供更加精密的技术，使血库用血的生物安全性得到进一步保证。
基因芯片可以针对单一病原体基因组的多靶点进行同时检测，以保证检测的可靠性。检测可靠性对于传染性疾病的早期检测是重要的，对于检测流感病毒等快速变异性病毒的意义尤为明显。由于流感病毒的快速变异性，只有针对多靶点设计多个基因探针进行同时检测，才可能保证病原体发生变异时，仍然可以早期快速地进行监测。根据基因芯片的高通量性，把多个病原体的基因探针显微集成到同一芯片上，还可以实现对多个相关的病原体进行诊断和鉴别诊断。
由于基因诊断的超前性，基因芯片技术用于诊断的优越性还体现在其不仅可能用于病原体早期预测，而且还可能通过谱图识别（pattern recognition），应用于健康管理和健康促进方面。
三．用于健康管理的基因芯片技术：
人类基因组计划（HGP）的实施，使得数以万计的人类基因序列被解码出来。将这些基因的代表序列作为探针，制备全基因组基因芯片，可以对机体的全部基因进行定时监测扫描，从亚健康阶段，及时发现基因的早期改变，进而对疾病或亚健康状态进行调理、预防、干预或早期治疗。
图3 可用于健康管理的全基因组基因芯片（44K）（略）
人类的健康是基因组与环境之间相互作用的平衡，随着自然环境、社会环境和居住环境大的改变，人类的生活习惯、饮食习惯和工作习惯常常表现出对改变的不适应。体现在机体对环境改变的反应方面，可见基因水平的异常表达。基因组的异常或表达异常，经历量变到质变的过程，最终必然造成各种各样的亚健康状况，进而将可导致疾病。
以营养为例，传统认为，营养不足可导致各种疾病；但近年流行病学研究发现营养过度（或营养过剩）也可导致心脑血管疾病、糖尿病并可加速衰老过程。如何确定不足和过度之间的平衡点，目前还没有分子水平的客观指标。全基因组基因芯片通过对正常人检测，可以确定正常状态下基因组谱及基因表达谱正态标准。通过与该正态标准谱图的比较，将可快速早期发现机体在基因组水平或基因表达水平的异常，从而及早预示亚健康状态或预警疾病的发生。
心血管疾病是危害人类健康的严重疾病。心血管疾病常常慢性发生，与高血压、冠状动脉粥样硬化以及一系列的慢性炎症过程相关。如何早期预警疾病并对既发疾病进行预后，对防治心血管疾病的发生和发展具有重要意义。通过把目前已知的相关生物标记物的基因，通过体外或原位合成，可制成相应的基因芯片。该基因芯片包括细胞粘附相关的基因、炎症相关以及细胞凋亡相关的基因，通过研究上述基因在疾病模型中的表达，可以揭示心血管疾病发病的分子机制，进而可以用于心血管疾病的研究和临床活检的检验上。
糖尿病是另一个慢性的常见疾病，多发于中老年人。糖尿病可分为不同的临床类型。Matos等采用转基因动物模型的方式，研究了环磷酰胺（cyclophosphamide）导致的实验性糖尿病的发病过程。I型糖尿病在理学上表现为胰岛ß 细胞附近进行性炎细胞浸润。这些炎症细胞起因于针对胰岛细胞自身免疫性反应。但炎症细胞浸润的确切机制一直未被阐明。采用基因芯片技术，研究者发现ß 细胞中功能基因表达明显降低，但化学趋化因子基因的转录(cxcl1, cxcl5, and ccl7)却显著性增高，并且干扰素异常高表达，竞达到所有转录子的50%左右。这一结果表明，采用基因芯片技术，可以更精确地分析疾病发生的病因机理，为进一步从分子水平设计预防和治疗方案提供前提。
基因芯片技术在风险预测方面的应用，是健康管理最重要的内容。由于基因芯片可以从分子水平早期对基因的表达改变进行分析，因而，其最有可能对疾病的危险因素进行早期监测，并对个体的健康管理提供最早期的数据资料。人类各种慢性疾病的发生和发展是渐进性的，包括癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经退性性病变、老年痴呆以及肥胖等等。由于恶性肿瘤对人类生命威胁越来越明显，采用基因芯片技术，针对肿瘤危险因子进行预测的临床试验已开始在西方发达国家开展。Van Veer 等采用基因芯片技术，发现了约70个基因的表达，比较临床淋巴结转移指标，该70个基因的表达异常，对乳腺癌的转移发生的预后显得更加客观。目前一个规模的临床试验研究正在开展，以验证基因芯片研究发现的这一结果，进而为乳腺癌转移危险因子的预测提供全新的基因芯片技术。该临床试验研究，开拓了基因芯片在临床风险评估中的应用。
我国传统医药中曾对医学的不同层次进行过描述，其中医学中最高境界是所谓的“上医治未病”。通过全基因组芯片对健康进行管理，进而有计划地开展健康促进，将可早期及时地预见并调整生活习惯，在疾病发生之前即对其进行预防。由此可见，用于健康促进的基因芯片技术是具有重要应用价值的。事实上，全基因组基因芯片从功能上十分类似于目前临床常用的CT或核磁共振成像等物理诊断技术。这些物理诊断技术对机体全身进行扫描，只能发现已经发生的疾病状况；而基因芯片则是从分子水平、从微观上对全基因进行扫描，发现机体在基因组或基因表达水平最早期的异常。因此，基因芯片技术不仅可应用于疾病患者，而且可应用于介于健康和疾病之间的广大亚健康人群，基因芯片可能为“上医”提供客观可靠的检测标准，使“治未病”成为可能，因而基因芯片的应用前景是广大的。
目前全基因组基因芯片在临床的应用方面尚未开展，主要原因是多方面的。第一：基因芯片目前的价格相对较高，不宜于广泛应用于临床的基因诊断实践；第二：配套的检测技术还有进一步改进的必要，特别是标记和杂交技术有必要优化和规范化；第三：由于全基因组基因芯片可一次性地检测数以万计的基因组或基因表达谱信息（图3），因而在应用过程中产生海量的数据。而对大量数据进行快速分析、储存、归类等，需要研究开发全新的生物信息学、系统生物学和计算生物学技术。目前相关的技术仍在发展过程中，可以预见在不远的将来，在上述技术瓶颈得以突破的情况下，基因芯片技术将可广泛地应用于临床、健康体检、健康管理和健康促进的各个领域。
结语：综上所述，基因芯片技术经过十余年的发展，已经逐步成熟，正在接近市场应用阶段。基因芯片技术的应用主要有两大方向，即特异性疾病诊断芯片与全基因组基因芯片。特异疾病诊断芯片主要针对具体的疾病、特别是传染性病原体的诊断与鉴别诊断；而全基因组基因芯片则通过谱图识别，不仅可用于临床疾病的诊断，而且可用于亚健康状态下的健康监测与健康管理，以达到预测疾病、预防疾病和健康促进的作用。
基因芯片可望从基因水平全面应用于健康管理和疾病诊断，可以预见在不远的将来，基因芯片新技术在疾病诊断和健康管理领域，将可能形成巨大的应用市场。
参考文献：（略）
